Сюжет первого эпизода обновлённого мультика начинается с того, что Дядя Фёдор возвращается в деревню Простоквашино, где хочет помочь Матроскину и Шарику спасти хозяйство, оказавшееся под угрозой из-за появления грызуна Тама-Тама.
В новых сериях «Простоквашино» появляется новый персонаж — сестра Дяди Фёдора Вера Павловна, которая, чтобы попасть в Простоквашино, спряталась в посылке.